基于叶绿素 ａ测定的分光光度法与 ｂｂｅ法比较：以千岛湖为例

   叶绿素 ａ是所有浮游植物中均含有的主要吸光 色素，其含量通常用来估量浮游植物的生物量和初级生产力，反 映水体的营养状况和作为水体富营养状况评价中的 关键参数监测水体叶绿素 ａ对 了解水环境质量现状及演变趋势具有重要意义。因 此，建立一种操作简单和结果准确的叶绿素 ａ测定 方法很必要。

   浮游植物叶绿素的测定方法主要有分光光度法 、荧光法和高 效液相色谱法。荧光法具有高 效、灵敏的优点，高效液相色谱法可以同时测定多种 色素且结果更准确，但这 ２种 方法所需仪器价格昂贵且操作复杂，难以作为常规 的监测方法。分光光度法具有操作简便、可靠性强 的特点而被广泛采用 。其他叶绿素 ａ测定方法还 包括水色传感器 ＳｅａＷｉＰＳ遥感法和机载海洋激光雷达法。这些方法 中有些已经使用了几十年，优点是可以充分将藻类 细胞壁破碎，对叶绿素的提取速度快、效率高，但是 采集样品过程需要按照一定的程序进行，样品的需 求量较大，在贮存、运输的过程中样品中叶绿素 ａ的含量可能发生变化，在研磨过程中叶绿素 ａ容易发 生光降解使结果偏低，而且提取过程操作繁琐，转移 过程中人为误差较大，导致叶绿素 ａ含量的测定结 果与水体实际含量存在一定的偏差。此外，研磨过程需花费较多 的时间和精力，与丙酮的接触时间长，不利于操作人 员的健康。在实际操作中，人们 已认识到丙酮 －研磨法存在的缺点，并从多方面如 提取液、提取方式、提取温度和提取时间等进行改进。

   ｂｂｅ藻类现场分析仪是德国 ｂｂｅ公司基于叶绿素的荧光反应特征研制的能潜入水体中快速检测叶绿素浓度的 仪器。ｂｂｅ藻类现场分析仪能 快速检测最深 １００ｍ处的叶绿素浓度，检测数据可 以通过串口在线显示或者存储在设备中等待后续分 析。除检测叶绿素含量，该仪器还可以检测到藻的 存在，并将藻按光谱分类（蓝藻／青蓝菌藻、绿藻、硅 藻／甲藻、隐藻）。在国外，利用 ｂｂｅ-ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｂ检 测分析藻类 （以下简称 ｂｂｅ法）应用较为广泛， 利用 ｂｂｅ法现场分析仪检测 水库浮游植物群落的组成及其动态变化，利用 ｂｂｅ法监测水体的藻类并预测 蓝藻暴发，比较 了不同方法测定叶绿素 ａ结果，ｂｂｅ法测定结果与 其他方法测定结果相关性较高。我们于 ２００９年７月至２０１０年 ６月，在大型深水型水库———千岛湖分 别使用分光光度法和 ｂｂｅ法测定水体的叶绿素 ａ浓度，验证二者测定结果的相关性，以期能找出结果更 精确、使用更方便的叶绿素 ａ测定方法。

１ 材料与方法

1.1 样点设置

   新安江是千岛湖最主要的入库地表径流，同时 是千岛湖营养盐主要的源头。新安江大坝是千岛湖 水流出口。根据千岛湖的水体形态、水流等特点，从 上游至下游设置 ３个采样点（图 １、表 １），分别位于 千岛湖的西北、中心和东南湖区。其中 Ｓ１点属于上 游河流区，流速较快，泥沙含量较大，水体浑浊；Ｓ４ 点位于中游过渡区，流速较缓，水体较为平静，水体 较为清澈，藻类生物量较高；Ｓ９点位于下游静水区， 水体最为平静且浮游动物较多，水体较为清澈。

1.2分光光度法测定 

   水样采集在每月中旬进行。根据各采样点水深 情况，对各点水样进行相应的分层采集。其中，Ｓ１ 按照 ０．５、４、８、１２、１６、２０和 ２５ｍ等水层依次采集； Ｓ４按照 ０．５、４、８、１２、１６、２０、２５和 ３０ｍ等水层依次 采集；Ｓ９按照 ０．５、４、８、１２、１６、２０、２５、３０、３５、４０、４５ 和 ５０ｍ等水层依次采集。采样方法和叶绿素 ａ的 测定按金相灿等（１９９０）方法进行。

1.3 ｂｂｅ法测定

   与分光光度法的水样采集同时进行。使用前， 先将仪器置于水体表层，完成对深度的校准。校准 完毕后，启动仪器的测量功能，匀速释放线缆，电脑 会自动记录测量的各项指标，当水深达到预定测量 水深时，停止测量，保存数据。

２ 结果与分析

2.1全湖叶绿素 ａ测定

   成对 Ｔ检验表明，分光光度法测定得到的叶绿 素 ａ含量显著高于 ｂｂｅ法的测定结果（表 ２）。对 ２ 种方法测得的全湖全年的数据进行相关性分析，发 现二者存在极显著的相关关系（ｒ＝０．８３，ｎ＝２９３， Ｐ＜０．０１），但个别数据差异较大（图 ２）。将分光光 度法测定的叶绿素 ａ浓度划分为 ３个浓度组，分别 与 ｂｂｅ法测定叶绿素 ａ进行相关分析。结果表明， 低浓度组（＜３μｇ／Ｌ）、中浓度组（３～１２μｇ／Ｌ）的相 关系数分别为 ０．４５２（Ｐ＜０．００１，ｎ＝２５０）和 ０．６８２ （Ｐ＜０．００１，ｎ＝４２），高浓度组（＞１２μｇ／Ｌ）仅 １对 样本，未进行相关分析。

2.2 相同月份叶绿素 ａ测定 

   相同月份叶绿素 ａ测定结果见图 ３。２种方法 测定出的叶绿素 ａ的最大值、最小值都是出现在相 同的月份。偏相关分  析表明，２种方法测定的叶绿 素 ａ的月份变化较为一致，偏相关系数站点 Ｓ１为 ０．８４１（Ｐ＜０．００１），Ｓ４为 ０．８５２（Ｐ＜０．００１），Ｓ９为 ０．７７８（Ｐ＜０．００１）。

2.3 相同深度叶绿素 ａ测定 

   相同深度叶绿素 ａ测定结果见图 ４。２种方法 测出叶绿素 ａ的浓度在各采样点的垂直变化趋势一 致，表层水中的叶绿素 ａ浓度最高，基本上都是随着 深度的增加叶绿素 ａ浓度逐渐降低，即水深越深，叶 绿素 ａ浓度越低。偏相关分析表明，２种方法测定８１ ２０１３年第 ２期 周 静等，基于叶绿素 ａ测定的分光光度法与 ｂｂｅ法比较：以千岛湖为例的叶绿素 ａ的垂直变化趋势也较为一致，偏相关系 数 Ｓ１ 点 为 ０．７９９（Ｐ＜０．００１），Ｓ４ 点 为 ０．８１３（Ｐ＜０．００１），Ｓ９为 ０．６６６（Ｐ＜０．００１）。

３ 讨论

3.1ｂｂｅ法数据低于分光光度法的原因

   分析发现，我国通用的标准分光光度法与国际 上运用较多的 ｂｂｅ法测定得到的叶绿素 ａ含量显著 相关，但后者比前者普遍偏小。分光光度法在叶绿 素 ａ提取过程中，如果使用塑料材质的离心管提取 叶绿素 ａ（丙酮对塑料具有腐蚀作用）或者冷藏时间 过长，测定的藻类叶绿素 ａ值都会偏大，本文采用塑料材质的离心管进行提取，从而 导致结果偏高。本研究采用的 ｂｂｅ法是根据高效液 相色谱（ＨＰＬＣ）分析的校准参数对叶绿素 ａ含量进 行定量的。叶绿素 ａ样品中含 有一些异质同晶体和其他叶绿素衍生物，分光光度 法能在 ６６５ｎｍ光谱下检测出这些物质，并将其作为 叶绿素 ａ的一部分；但 ｂｂｅ能识别这些物质，未将其 作为叶绿素 ａ的一部分，从而导致 ｂｂｅ法测定数据 低于分光光度法。而且，本研究 使用的 ｂｂｅ法能减少黄色物质（即有色可溶性有机 物，ＣＤＯＭ）的影响，导致 ｂｂｅ法数据比分光光度法 偏低。ＣＤＯＭ存在于所有自然水体中，是溶解性有 机物的重要组成部分， 在紫外短波光的激发下会发出长于吸收光波长的荧 光；ＣＤＯＭ的吸收还延展到可见光 的蓝光部分，与浮游植物叶绿素 ａ和非生物悬浮颗 粒物的吸收重叠，从而影响水体初级生产力（。有研究表明，在沿岸水 域，若忽略了黄色物质的影响，将使叶绿素浓度下降 ３５％ ～６０％。

3.2水文条件对 ２种方法测定结果的影响

   比较 ３个样点 ２种方法的周年叶绿素 ａ测定结 果，Ｓ１点相关性偏低，特别是 ２００９年 ８月和 ２０１０ 年 ４－５月分光光度法的测量值要明显高于 ｂｂｅ法。 Ｓ１点位于新安江来水方向的zui前沿，属于河道型的 环境，因此水流要强于其他区域。在 ２００９年 ７月末 和 ２０１０年 ３月，该流域经历过大面积的降雨，因此 过水量增加，水位升高，水体流速变快。由于我们所 使用的分光光度法采样时定深是依靠所释放的缆绳 的长度来衡量的，所以在水流比较急的情况下，对于 深度的定位偏差较大，所采水层可能并未达到目标 深度，而较浅处通常情况下光照条件更好，浮游植物 生物量和叶绿素含量都较高些；ｂｂｅ法采用的是压 力定深，每次使用前还根据当时的大气压力进行校 ８２ 第３４卷第 ２期 水 生 态 学 杂 志 ２０１３年 ３月准，因此深度定位是比较准确的，不会受到水流的影 响。所以，在这 ２个时期，由于水文条件导致的采样 误差，致使分光光度法的结果与 ｂｂｅ法结果有较大 的差异，也说明分光光度法在采样过程中存在流水 中深度定位不准的瑕疵，不适于河流等水体扰动较 大和采样平台不稳定的水体环境。Ｓ４点和 Ｓ９点是 静水区，风浪水流均较小，虽然分光光度法的测定值 偏大，与 Ｇｒｅｇｏｒ等（２００４）的研究结果相似，但 ２种 方法的测定结果相关性较高，Ｒ值接近。 最后需要指出的是，尽管低浓度组和中浓度组 ２种方法测得的叶绿素 ａ含量的相关性均达到了显 著水平，但均较明显地低于全浓度组，可能与划分浓 度组后，各浓度组的变异范围即变化尺度变小有关。 低浓度组的相关性下降比较多，可能是浓度低组人 为测定误差对数据的“贡献"大于高浓度组，对相关性的影响较大。